Mark Ruffalo nació el 19 de octubre de 1967 en la ciudad industrial de Kenosha, en el estado de Wisconsin, en Estados Unidos. Sin embargo, su descendencia proviene originalmente de la comuna de Girifalco en la provincia de Catanzaro, en la región italiana de Calabria y además posee raíces francocanadienses. Su padre se llama Frank Lawrence Ruffalo, y es un pintor de construcciones, y su madre es Marie Rose, una peluquera y estilista.[ Ruffalo tiene dos hermanas, Tania y Nicole, y un hermano, Scott. Ruffalo se ha descrito asimismo como un “niño feliz” proveniente de una “familia italiana numerosa y llena de amor”. Durante su niñez asistió a una escuela de tipo progresiva y fue educado bajo la Fe bahá’í, de la cual su padre era miembro. La adolescencia de Mark transcurrió en Virginia Beach, Virginia, donde su familia se trasladó por motivos laborales. Allí se graduó en el instituto llamado First Colonial High School. Luego se mudó con su familia a San Diego, California, para más tarde trasladarse a Los Ángeles. En esta ciudad se incribió en clases de interpretación en el Conservatorio Stella Adler y co-fundó la compañía teatral Orpheus, en la que escribía guiones, dirigía y protagonizaba numerosos personajes. A partir de este momento pasaría los siguientes nueve años de su vida trabajando como barman.