Worthington nació en Godalming, Surrey, Inglaterra, y se mudó a Perth, Australia, durante su infancia.  Su padre, Ronald, era empleado en una planta energética, mientras que su madre, ama de casa, le crió a él y a su hermana. Asistió al John Curtin College of The Arts, pero finalmente abandonó la escuela a los diecisiete años y se dedicó a la construcción y a algunos trabajos esporádicos, estableciéndose en Sídney.  Cuando tenía diecinueve años y trabajaba como albañil, hizo una prueba para el National Institute of Dramatic Art (NIDA) y fue aceptado.

Después de graduarse en 1998, Worthington realizó una producción sobre el Beso de Judas para la productora Company B en el Belvoir St Theatre. Siguió actuando en una serie de Australia, en películas y series de televisión, incluyendo una función, Bootmen y actuaciones en Dirty Deeds, Gettin Square (El Desquite),Somersault y Macbeth. Worthington ganó en el 2004 el Premio al Mejor Actor Principal por su papel en Somersault. Es muy conocido en Australia por su papel de Howard en la aclamada serie de televisión australiana Love My Way.

La carrera internacional de Worthington en el cine comenzó con una serie de pequeños papeles en Hollywood en producciones como Hart’s War (La Guerra de Hart) y The Great Raid, que se rodó en Australia. Fue uno de varios actores candidatos para hacer el papel de James Bond (que Pierce Brosnan había dejado) para la película de 2006 Casino Royale. El director, Martin Campbell declaró que sólo Worthington y Henry Cavill resultaron finalistas y en reñida competición con el que fue el ganador al final, Daniel Craig.

En 2007, James Cameron eligió a Worthington para el papel principal para la película Avatar. El 12 de febrero de 2008 saltó la noticia de que había sideo elegido, por recomendación de Cameron, para el papel de Marcus Wright en Terminator Salvation, película ya estrenada en el mundo entero.